摘要：新城疫病毒在不断的变异，不同毒株对鸡的致病性差别很大，快速准确的诊断该病可减少养禽业的损失。本文就新城疫诊断技术进行概述，主要包括临床、病毒分离鉴定、血清学以及分子生物学诊断技术。

关键词：鸡新城疫；诊断技术

鸡新城疫（ND）又称亚洲鸡瘟，是由副黏病毒科禽腮腺炎病毒属的禽副黏病毒Ⅰ型（APMV-1）新城疫病毒引起的高度接触性禽类烈性传染病。以呼吸道症状为特征，同时伴发神经症状、胃肠道病变和头部肿大。世界动物卫生组织（World Organization for Animal Health，OIE）将其列为A类动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。自1926年确认此病以来，诊断技术的发展对该病防控起到至关重要的作用。

1.临床诊断

1.1临床症状

该病一年四季均可发生，但以冬季最为严重，不同日龄的鸡均易感，以幼雏和中雏易感性最高。本病的潜伏期为21天，典型症状如下^[1，2]：发病急、死亡率高；体温升高、极度精神沉郁、呼吸困难、食欲下降；粪便稀薄，呈黄绿色或黄白色；发病后期可出现各种神经症状，多表现为扭颈、翅膀麻痹等。免疫鸡群中发生新城疫，临床诊断症状不很典型，仅表现呼吸道和神经临诊症状，其发病率和死亡率较低，有时在产蛋鸡群仅表现产蛋下降^[3]。

1.2 病理变化

1.2.1 剖检病变

全身黏膜和浆膜出血，以呼吸道和消化道最为严重；腺胃黏膜水肿，乳头和乳头间有出血点；盲肠扁桃体肿大、出血、坏死；十二指肠和直肠黏膜出血，部分可见纤维素性坏死病变；脑膜充血和出血；鼻道、喉、气管黏膜充血，偶有出血，肺可见淤血和水肿^[1，2]。

1.2.2 组织学病变

多种脏器的血管充血、出血，消化道黏膜血管充血、出血，喉气管、支气管黏膜纤毛脱落，血管充血、出血，有大量淋巴细胞浸润；中枢神经系统可见非化脓性脑炎，神经元变性，血管周围有淋巴细胞和胶质细胞浸润形成的血管套^[1，2]。

1.2.3 电镜技术

随着电镜样品制备方法不断改进以及电镜技术的不断更新，利用电镜技术快速识别和检出临床样品中的病毒和病毒成分已成为可能。李成等用磷酸氢钙离子交换捕捉法对鸡粪及肠内容物进行纯化，采用常规负染后进行电镜检查，能够比较清晰地观察到NDV粒子。常国权等采用人O型红细胞吸瞥鼻放病毒的方法纯化鸡粪中的NDV，负染后电镜检查，可观察到大量的NDV粒子，且杂质较少，其敏感度比直接负染镜检法提高20倍以上。

1.2.4 免疫组化技术

免疫组化技术是以辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记抗体，直接浸染组织标本印片或冰冻切片的免疫检测方法，具有快速、准确等特点。其方法是：常规制备组织切片，滴加鸡抗NDV高免血清，PBS振荡，滴加标记的兔抗鸡酶标抗体，最后滴加底物，水洗，轻染苏木素，常规透视，封片，镜检。该技术能证明组织和器官中存在的特异性病毒或抗原，提供快速的诊断方法。

2. 实验室诊断

2.1 病原学诊断

2.1.1 病毒分离鉴定^[1~4]

⑴ 样品采集

当认为鸡群发生ND，引发严重疾病导致高死亡率时，通常是从死亡不久的禽或人为杀死的濒死禽进行病毒分离。从死禽采集的样品有口鼻拭子，还有肺、肾、肠（包括内容物）、脾、脑、肝和心组织，这些样品可单独或者混合存放，但肠内容物常需单独处理。从活禽采集的样品应包括气管和泄殖腔拭子，后者需要带有可见粪便，对雏鸡采集拭子容易造成损伤，可采用收集新鲜粪便代替。样品采集应在疾病初期进行。

样品采集原则：采集样品时，必须有严格的无菌概念，采集不同发病禽或死亡禽的病料应放置不同的容器中保存。采集的样品必须有代表性（采集具有典型临床症状），每一发病群最少应采集5只发病禽。

⑵ 样品处理

样品置于含抗生素的等渗的0.01M PBS（pH 7.0~7.4）中，抗生素视具体情况而定，但对组织和气管拭子保存液应含青霉素（2000U/mL），链霉素（2mg/mL）；卡那霉素（50μg/mL）和制菌霉素（1000U/mL）；而对粪便和泄殖腔拭子其浓度应提高5倍。加入抗生素后调节pH值到 7.0~7.4。粪便和捣碎的组织，应用抗生素溶液制成10~20%（W/V）的悬浮液。采集的样品应尽快处理，首先在室温下静置1~2小时。如果没有处理条件，样品可在4℃ 保存，但不超过4日。

⑶ 病毒培养

粪便或组织的悬浮液在室温下（不超过25℃）1000g离心后的上清液，经尿囊腔接种至少5枚9~11日龄的SPF鸡胚，0.02mL/枚，35~37℃孵育4~7日。弃去24小时内死亡鸡胚，收集24小时后死亡的和濒死鸡胚尿囊液，于4℃冷却，随后检测尿囊液的HA活性。阴性者至少用另一批蛋再传代一次。

⑷ 病毒鉴定

应用NDV标准阳性血清进行HI试验可以鉴定NDV。但是，应考虑以下因素，在无菌收集的尿囊液中能检出 HA活性，可能是由于存在15种血凝亚型之一的流感病毒或者其它8个血清型之一的副粘病毒（未灭菌的尿囊液可能含细菌性HA）。用特异的抗血清可以证明 NDV的存在。通常使用鸡的抗血清，它们是用NDV毒株中的一个株制备的。NDV和APMV-3在HI试验中可能发生交叉反应，可以使用合适的抗原和抗血清对照解决此问题，另外，单抗的使用将会很好解决这个问题。

2.1.2 病原指数测定

不同NDV分离株的毒力差异显著，而且由于新城疫活疫苗的广泛应用，仅从具有临床症状的病禽分离病毒进行鉴定，还不能对ND作出确诊，因此，需要对分离毒株的致病性进行毒力评价。目前常用的方法为体外试验，采用鸡胚平均致死时间（MDT）、脑内致病指数（ICPI）、静脉致病指数（IVPI）测定对致病性进行评估^[4]。判定标准：MDT低于60h为强毒型NDV，在60~90h为中等毒力型NDV，大于90h为低毒力NDV；ICPI越大，NDV致病性越强，最强毒力病毒的ICPI接近2.0，而弱毒株毒力的ICPI为0；IVPI越大，NDV致病性越强，最强毒力病毒的IVPI可达3.0，而弱毒株的IVPI为0。

2.2血清学诊断

2.2.1 血凝抑制试验

NDV病毒粒子的囊膜上存在血凝素(HA)，能凝集鸡和多种动物的红细胞，同时病毒进入鸡体后，在鸡的血清中能产生抗红细胞凝集素的抗体，抑制血凝现象，所以可以用HA和HI试验对ND进行定性的检测。HA和HI因具有操作简单、不需特殊的仪器等优点，是目前最常用的方法，大多数的鸡场都用HA和HI试验进行抗体监测和用于ND的诊断。当血凝抑制价在1：20以上者，确定被检鸡过去患过新城疫或接种过新城疫疫苗。该方法已纳入中华人民共和国国家标准GB16550-2008《新城疫诊断技术》^[1]和台湾家畜禽疾病实验室诊断标准中^[4]。

2.2.2血清中和试验

血清中和试验既可用已知抗鸡新城疫病毒的血清来鉴定可疑病毒，又可用已知的新城疫病毒来测定鸡血清中是否含有特异性抗体，以确定鸡群是否感染过新城疫。常用固定血清－稀释病毒法。过去从未接触过NDV的正常鸡血清能中和高达100 ID₅₀的病毒，因此必须高于此值才能判为阳性。在10～20天前感染新城疫的鸡，其血清通常能中和10³~10⁶ ID₅₀的病毒。NDV各毒株在抗原性上没有区别，但是产生中和抗体的能力却有差异。

2.2.3 琼脂凝胶扩散试验

琼脂凝胶扩散试验(agar gel immunodiffusion，AGID)是使可溶性抗原和相应抗体在含有电解质的琼脂凝胶中扩散相遇，特异性地结合形成肉眼可见的线状沉淀物的一种定性检测方法。该法操作简便，不需要特殊设备，且有较好的特异性和检出率，故广泛应用于检测病毒抗原和进行毒性鉴定，以及病毒感染或疫苗免疫后的抗体检测。

3. 分子生物学诊断

分子诊断技术包括用RT-PCR或相关技术来检测ND病毒的毒力。有报告报道应用这些分子技术检测临床样品的ND病毒，其优点在于能快速检出病毒，若其引物包含F0裂解位点的编码基因，甚至能区分病毒毒力。但在检测临床样品时须注意其对某些组织器官，尤其是对粪便的灵敏度很低。

3.1 RT-PCR

RT-PCR技术是一种选择性体外扩增DNA或DNA片段的方法，具有特异、快速、灵敏、简便等优点。目前该方法在NDV检测和诊断中的应用也很广泛。1991年Jestin V首先建立了鉴定NDV的RT-PCR方法，以鸡胚来增殖病毒，从感染病毒尿囊液中提取RNA进行RT-PCR，该方法有很高的特异性，能用于NDV的检测和诊断。Angela等报道了采用RT-PCR检测德国最近分离的近200株NDV分离株，结果符合率达90%。2000年Gohm等建立了一种可以直接检测组织和粪便中NDV的RT—PCR方法。该方法能从组织中直接检测病毒，无需经鸡胚增殖，可以在试验感染和接触感染鸡的组织和粪便中检测到NDV。虽然该系统是十分成功的，但必须指出的是，由于不同毒株的组织嗜性的差异没有哪一个器官可以总是病毒阳性，所以取样时一定要包括足够广泛的组织器官。

3.2核苷酸序列测定

    近年来，随着各类酶制剂和设备的广泛应用，核苷酸序列测定已经从一种繁琐废力的工作变成几乎可以完全自动化完成。另外，NDV F蛋白裂解位点序列已经被接受为病毒毒力评定的指标，且已引入到ND的定义当中。以上的种种进展使得继Collins等(1993)之后，众多采用核苷酸序列测定作为研究工具的学者们不断涌现。还有一些人甚至利用此工具来进行病毒致病性分型。台湾家畜卫生试验所在实验室诊断标准操作中已将其纳入其中^[4]。

3.3核酸探针技术

核酸探针技术是在已经获得的病毒特异片段上标记放射性同位素或生物素作为探针而建立的一种分子杂交诊断方法。1992年Jarecki Black J C等用一个长30个碱基的探针与14个NDV分离株做狭缝印迹杂交试验，来区分NDV与其它禽类病毒。病毒感染组织样品和鸡胚增殖均可用该办法检测，不足的是无法区分自然感染鸡和免疫鸡。为此，Jareeki Black J C等又设计了2个探针，可与11个速发性毒株、5个中发性毒株的RNA杂交，而不能与所有7个弱毒株的RNA杂交，具有重要的应用价值。2001年Aldous等设计6个能与许多不同F基因裂解位点杂交的TagManTm荧光标记探针。在该技术中，以感染尿囊液中提取的RNA为RT-PCR模板。RT-PCR反应体系中含有探针，无需PCR后的操作，最大限度地降低被污染的风险。该试验能在强弱毒株混合物中同时鉴定两种成分。

3.4 RNA指纹图谱

Mcmillar B C等^[7]首先应用RNA指纹图谱法对NDV RNA进行了分析。其方法是将病毒RNA提纯后，用T1 RNA酶降解产生大小不同寡核苷酸片段，放射性同位素标记后进行垂直双向电泳，再经放射自显影得到特征性RNA指纹图谱，不同的毒株RNA组成和序列有差异，可通过指纹图谱反应出来。随后他们又对多株NDV进行了指纹图谱分析，确定了其图谱和同源性。Palmieri S等^[8]利用此法分析Bl、QUS及UIS等株，分辨出了约100个寡核苷酸片段，确定了50个～80个片段是共有的。由于该方法放射性污染较大，随后，Palmieri等又对此法进行了改进，原来是在病毒培养过程中掺入同位素，而改进后的方法是在RNA抽提后，既用TlRNA消化，然后用聚核苷酸激酶及同位素在各片段的5‘末端进行标记，这样减少了放射污染的机会。