摘要：保护剂和冷冻干燥技术是目前保证活疫苗质量的关键环节，研究冻干活疫苗的稳定性对于提高疫苗质量及加快新疫苗的开发具有重要的现实意义。本文在综述冷冻干燥对疫苗损伤机理的基础上，对冻干保护剂保护机理的研究及在生产和贮运过程中影响疫苗稳定性的因素进行了阐述。

关键词： 疫苗 冻干保护剂、冷冻干燥、稳定性

保护剂是冷冻干燥生物制品中不可或缺的一部分。国外已经有保护性能优良的冻干保护剂，并运用于商业生产中。我国保护剂的研究方面起步较晚，现已在这方面的研究取得了一定的成果，如王栋等已经研制出7种耐热冻干保护剂并获得新兽药证书，用此保护剂冻干的疫苗在2～8℃条件下，保存24个月以后，病毒滴度无明显下降，这一成果提升了我国疫苗的行业进步。

冻干保护剂的研发有以下作用：（1）具有保护病毒及细菌活力、抗原稳定性、遇热不会焦糖化、耐干燥和冷冻的低分子物质和形成冻干活疫苗耐热性结构的有机高分子物质；（2）具有高度抗氧化作用的抗氧化剂，它能够最大限度地消耗溶液中溶解的氧，减少病毒或细菌与氧的接触，降低病毒或细菌的代谢活力和能量损耗，防止其在冷冻干燥及储运过程中死亡；（3）依据耐热保护剂中的每一种物质的共融点进行大量反复冻干试验（包括每一种疫苗病毒的存活率、抗原性和免疫原性，病毒的保质期等），科学地确定每一种活疫苗的冻干曲线，使病毒或细菌在冻干过程中的失活率降到最低程度，也使冻干疫苗形成良好的物理性状。

目前，在耐热冻干保护剂活疫苗生产实践过程中经常出现质量不稳定等问题。为此，本文着重从冷冻干燥对疫苗的损伤机理、保护剂的作用机理等方面分析了影响耐热冻干保护剂活疫苗稳定性的诸多因素。

1 冷冻干燥对疫苗的损伤机理研究

冷冻干燥是目前用于微生物、蛋白质等生物制品干燥保存的最常用、最有效的方法。但是，在真空冷冻干燥过程中，冷冻和干燥不可避免地会造成部分微生物细胞的损伤及死亡，导致蛋白质变性[1]。为提高冷冻干燥生物制品的存活率与生物活性，人们进行了大量的研究，其中包括冻干过程中蛋白质的空间结构变化，各种保护剂对蛋白质的影响。

蛋白质的折叠与展开状态的平衡受周围物理环境（例如，pH值、温度、溶剂成分、水合水平等）的影响很大。从二十世纪六、七十年代开始，国外一些学者对冻干蛋白质的变性机理进行研究，当时认为变性主要发生在冷冻过程[2]。从二十世纪八、九十年代至今，普遍认为在冷冻干燥过程中冷冻和干燥都会引起蛋白质变性[3]。

1.1 冷冻变性机理

Chilson等[4]认为冷冻过程中结晶引起水的状态和结构的变化是蛋白质变性的主要原因，并且蛋白质变性的程度依赖于冷冻的程度，冷冻温度越低，蛋白质变性越剧烈。有的研究者[5]认为，在低温下有序的水的结构引起蛋白质分子中疏水键的破坏是导致蛋白质变性的主要原因。Shikama[6]和Yamazaki[7]于2000年开始定量研究低温对蛋白质模型的影响，他们发现牛肝过氧化氢酶在不同低温条件下活性保留程度不同。低温引起变性的原因：非极性基团在水中的溶解度随温度的降低而增加，从而导致蛋白质中的疏水作用减弱[8]。大多数研究者认为蛋白质分子周围分布着多层水分子，在降温过程中，蛋白质分子周围的水分子不断冻结，但只要蛋白质分子表面的单层水分子没有冻结，蛋白质就不会变性，反之亦然。Hanafusa[9]将稳定的卵清蛋白(ovalbumin)和不稳定的肌球蛋白(myosin)进行冷冻干燥对比实验，结果表明：随着温度的降低，肌球蛋白中的未冻水含量逐渐降低；卵清蛋白中的未冻水含量在低于0℃后开始下降，在-20℃～-45℃基本不变，当温度低于-45℃后，随着温度的降低，未冻水的含量又开始下降。由此分析，卵清蛋白温度从0 ℃降到- 20 ℃的过程中，未冻水含量下降，说明蛋白质分子周围的多层水分子冻结；温度从- 20 ℃降到- 45 ℃的过程中，未冻水含量保持不变，说明蛋白质表面覆盖着没有冻结的单层水分子，正是由于单层水分子的存在，才使蛋白质在冷冻过程中不发生变性作用；当温度低于- 45 ℃后，未冻水含量又开始降低，说明蛋白质表面的单层水分子开始冻结，蛋白质分子表面的氢键以及极性基团就会暴露在周围环境中而变性。在冷冻过程中没有变性的蛋白质，在干燥过程中也应保证蛋白质分子表面的单层水分子不受到破坏。

冷冻变性主要受浓缩影响、冰水界面的影响、pH值变化的影响和相分离的影响[10]。对不同蛋白质来说，这些影响可能同时起作用，或只有部分因素起作用。

（1）浓缩影响：由于组成溶液的各种物质不是同步结冰的，水先结冰，导致在冷冻过程中溶剂的浓度逐渐提高，促进降解化学反应速率的提高，导致变性[11]。例如在部分凝固的溶液中氧浓度会增大，导致蛋白中巯基的氧化速度加快[12]。

（2）冰水界面影响：蛋白质可能吸附在冰水界面上，使结构疏松导致产生界面诱导的变性。

（3）pH值变化的影响：当pH值改变，溶液的离子强度将发生变化，使蛋白质中的极性基团之间的静电排斥力加大，导致蛋白质结构发生变化。

（4）相分离的影响：研究表明液液相分离形成的界面能使蛋白质变性。相分离的影响，根据国外研究可以采用改变溶液中的盐类、调整高分子之间的比例和化学修饰蛋白质等措施来改善[6]。

1.2 干燥变性机理

    干燥过程的变性主要是发生在二次干燥阶段即移去结合水的阶段。蛋白质在水溶液中是水化的，表面有一层水分子包围，构成一个单层分子，这就是水化层。这层水分子通过氢键和蛋白质相互作用连接。干燥过程要移去一部分水化层的水，破坏蛋白质表面的氢键结构，引起天然结构的变性。这是由于失去氢键的蛋白质可能把氢转移给羧基，减少蛋白质中的电荷分布，电荷密度降低有利于蛋白质之间的疏水相互作用增强，促进凝聚形成，导致变性[13]。

2 耐热保护剂作用机理研究

冻干生物制品的整个冻干过程存在着各种各样的应力，通常包括低温应力、冻结应力（包括枝状冰晶的形成、离子强度的增加、pH值的改变、相分离等）、干燥应力（移去蛋白质表面单层水分子）等，这些应力常常是直接或间接导致生物制品不稳定的因素[7]。保护剂可以改变生物样品冷冻干燥时的物理、化学环境，减轻或防止冷冻干燥或复水对细胞的损害，尽可能保持生物样品原有的各种理化特性和生物活性[14]，同时对产品贮藏期内蛋白质变性起到抑制作用，因为疫苗在贮藏期的变形率往往高于整个冻干过程[15]。

许多学者研究了保护剂对蛋白质的保护机理，认为保护剂通过减少蛋白质中的结合水含量，并且加强蛋白质和剩余结合水分子之间的相互作用力来防止蛋白质变性[5]。关于保护剂在冷冻干燥过程中使蛋白质稳定的机理目前有两种观点：一种认为具有粘性的保护剂包围在蛋白质分子的周围，阻止蛋白质的伸展和沉淀；另一种认为由于蛋白质分子中存在大量氢键，结合水通过氢键与蛋白质分子连接，当蛋白质在冷冻干燥过程中失去水分后，保护剂能通过氢键与蛋白质分子相连，这样可以保护氢键的连接位点不直接暴露在周围环境中，从而减少蛋白质的变性[16]。

常用的耐热保护剂种类有多羟基化合物、糖、蛋白质、聚合物、氨基酸、盐、表面活性剂等。

2.1 多羟基化合物

多羟基化合物是耐热保护剂的重要成分之一，常见的有甘露醇、肌醇、山梨醇、聚乙二醇、侧金盏花醇等[17]。多羟基化合物的保护机理：由于疫苗蛋白质分子中存在大量的氢键，结合水通过氢键与蛋白质分子连接，当冻干过程中脱水后，多羟基化合物的羟基能替代蛋白质表面的水分子的羟基，与蛋白质表面形成一层假定的水化膜，从而保护氢键的连接位点不直接暴露在周围环境中，稳定蛋白质的高级结构，防止蛋白质因冻干而变性。甘露醇不仅可作为优良的骨架剂使用，而且在一些组方中它能够兼作冻干保护剂[13]。甘露醇对疫苗的保护作用与其浓度和形态结构有关，而其浓度与结晶形态呈一定的相关性。无定型甘露醇具有稳定疫苗中蛋白质的作用，而结晶态的甘露醇则失去保护功能；1%或更低浓度的甘露醇通过无定型结构的形成阻止疫苗中蛋白质的聚集，而高浓度的甘露醇则易于形成结晶促进蛋白质的聚集[18]。

2.2 糖

糖是最常见、使用最广的一类必要耐热保护剂成分，为蛋白质的非特异性稳定剂，在冻干及保存各阶段均能对生物制品起到一定的保护作用。常见的有蔗糖、乳糖、海藻糖、菊糖、糊精等。糖的保护作用：二糖对阻止蛋白质二级结构的改变、冻干处理过程中及贮藏期内蛋白质多肽链的伸展和聚集起着显著作用[19]。多数研究显示，大分子糖类对蛋白质的保护作用似乎小于小分子糖类[7，20]。也有研究结果相反，如对大分子量的菊糖研究表明，聚合度高于5.5~6.0的菊糖对碱性磷酸酶的活性保护作用显著高于海藻糖或低聚合度的菊糖[21]。这也说明多糖的保护作用不能一概而论，特别在贮藏期，右旋糖酐可升高生物制品的玻璃化温度；葡萄糖可部分保持无定型状态，从而保护蛋白质，但葡萄糖为还原糖，有时不适合作保护剂。

海藻糖是一种在自然界分布广泛的双糖，近年来以其抗干燥特性受到广泛关注。海藻糖是一种非特异性保护剂，对生物分子具有一定的保护作用，具有稳定干燥的蛋白质的功能。目前对海藻糖稳定蛋白质的确切机制尚不清楚。一种“水替代”理论认为，当进行干燥过程时，生物分子表面失去束缚的结合水，导致其结构发生不可逆转的变化，海藻糖可在生物分子表面依靠带电荷的水合基团间的氢键形成保护膜，从而代替维护三级结构所必需的水分子，稳定其原有的空间结构；另一种“玻璃态”假说认为，海藻糖的作用在于形成一种玻璃体结构，而不是结晶体，它导致无定型连续相的形成，在结构上与玻璃状的水相似，起“冻结”生物分子的作用[22]。

2.3 蛋白质

    蛋白质保护剂是耐热冻干保护剂的重要组分。蛋白质类保护剂根据来源可分为两种：一种是动物源性蛋白质，另一种为蔬菜源性蛋白质。动物源性蛋白质主要包括血清白蛋白，明胶等。蔬菜源性蛋白质目前研究的主要是大豆蛋白、玉米蛋白粉等。US2006/029849专利[23，24，25]研究表明，在冻干传染性支气管疫苗时，添加蔬菜源性蛋白质比添加动物源性蛋白质，冻干前后病毒下降滴度减少；同时蔬菜源性蛋白质比动物源性蛋白质更安全，避免了血清蛋白质潜在的血源性病原体污染疫苗。

2.4 聚合物

    聚合物作为大分子物质保护剂，要与小分子物质联合使用，常见的有聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、明胶、聚乙烯亚胺。通常聚合物的稳定作用取决于聚合物的多重性质，如优先从蛋白质表面析出、表面活性、使蛋白质溶液浓度升高从而阻止其他小分子(如糖及多经基化合物)的结晶、抑制冷冻过程中pH值的剧烈变化等。PVP主要通过与糖类间的氢键作用和改变糖类的玻璃化温度发挥作用，不同聚合度及浓度的PVP所提供的保护作用不同。Taylor等[26]在研究糖类-多聚物间作用时，发现蔗糖在一定的糖-多聚物比例时，与PVP间有较大的氢键作用，而这种作用要大于所研究的其它二糖如海藻糖和单糖，这是因为聚合度大的PVP有着较高的玻璃化温度，随着PVP浓度及分子量增加，水溶液的粘度随之变大，蔗糖的玻璃化温度明显升高，对冷冻过程中的蛋白质的保护作用也随之有所增加；但聚合度过大时，聚合物会在冷冻过程中结晶，从而失去对蛋白质的保护作用，而且浓度及分子量过大时会增加最终产品的水分，使得制品中蛋白质变得更不稳定。

2.5 氨基酸

氨基酸是常见的蛋白质保护剂之一，常用的氨基酸类保护剂有脯氨酸、色氨酸、谷氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸盐酸盐、肌氨酸、L-酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等。在冷冻过程中，低浓度的甘氨酸可通过抑制10-100mmol/L磷酸缓冲盐结晶所致pH值的改变而阻止蛋白质变性[27]。无定型甘氨酸可阻止冻干过程中重组人生长激素的聚集；结晶型甘氨酸能升高成品的塌陷温度，阻止因塌陷而引起的蛋白质结构的破坏。

3. 影响耐热保护剂冻干疫苗稳定性的主要因素

耐热保护剂冻干疫苗的稳定性受到多种因素的影响，主要包括水分含量、保护剂、冻干工艺、玻璃转化温度等。

3.1 水分含量

    水分含量是疫苗质量是否合格的重要指标。水分含量主要影响疫苗的玻璃转化温度（Tg），即疫苗的水分含量越低，其Tg越高，稳定性越强。通常冻干疫苗的水分含量要求控制在1%~2%，以保持稳定性。在水分含量较低时，疫苗的溶剂降解反应呈零级动力学模式[28]。用动力学方程计算可以选择控制适宜的水分含量，既能满足疫苗在保存期稳定的要求，又避免在生产中因过度干燥而引起能源浪费，还可以为选择成品保存允许的环境湿度提供依据。除了必要的环境条件，包装材料的选择也很关键。有研究表明氯丁基橡胶塞对水分的透过率比溴丁基橡胶塞高[29]。

3.2 耐热保护剂

耐热保护剂是保证冻干疫苗质量的另一重要因素，其保护效能主要受保护剂原辅材料、保护剂组分浓度、保护剂配制方法、保护剂pH等方面的影响。

3.2.1耐热保护剂原辅材料

在冻干和储存过程中，偶然发生的原辅材料结晶现象，会影响疫苗的稳定性。例如，无定型状态的甘露醇可以处于亚稳定状态的玻璃态，其Tg大约为45℃，当疫苗温度超过Tg时，甘露醇由玻璃态转变为晶体，其无水结晶的形成使基质中水分分布发生变化，水分从无定型状态的甘露醇中转移到剩余的基质中，导致基质的Tg下降，引起疫苗的团块出现萎缩现象[30]。Zografi等认为[31]水分对疫苗稳定性的影响不仅与其含量有关，同时还与其分布状态有关。因此，含有结晶原辅材料的疫苗在冻干过程中可采用先升温后缓慢降温的过程，通过升高温度使其结晶完全或添加其它成分达到稳定疫苗的作用[32]。

原辅材料的选购、配制、灭菌、保存和使用，对于耐热冻干保护剂活疫苗的质量起着至关重要的作用，如在耐热保护剂配制过程中，使用不同厂家生产的原材料进行疫苗的冻干，结果可导致疫苗在耐老化试验后效力检验达不到质量标准的要求。此外，原辅材料中的杂质也会对冻干疫苗的稳定性产生影响，如甘露醇中的还原糖杂质氧化产生的席夫氏碱加合物可使环状七肽发生互变异构和水解反应[33]，而PEG则通过自由基反应产生的降解产物使溶菌酶的稳定性变差[34]。

3.2.2保护剂组份浓度

同种保护剂不同浓度对疫苗的稳定性也会产生较大影响。刘占杰等[35]研究表明，对于同一种保护剂，保护剂浓度高的脂质体的玻璃转化温度高，如海藻糖浓度由5%提高到15%，其脂质体的玻璃转化温度由-31.4℃提高到-29.2℃，提高了约2℃。

3.2.3保护剂配制方法

    耐热保护剂的配制对疫苗的稳定性同样起重要作用。在配制过程中应注意以下几点：（1）配制用水的标准；（2）称量的准确度；（3）保护剂的溶解顺序；(4)大分子物质与小分子物质混合比例；（5）保护剂贮存温度。以上任何一个环节出现问题，都可能会影响耐热保护剂的性能，导致耐热保护剂失去保护病毒的作用，从而导致耐热保护剂活疫苗质量的不稳定。

3.3 冻干工艺

3.3.1分装阶段

在冻干前，疫苗要经过配液，过滤及分装等过程，期间疫苗处于水溶液这一相对不稳定状态，即使相对较短时间，也可能发生降解反应。因此应加快各操作步骤，尽量缩短该过程持续时间，以防溶质发生沉淀，进而导致疫苗稳定性降低。

3.3.2冷冻干燥阶段

在冷冻过程中，当疫苗温度低于热力学冰点时，随着纯冰晶从溶液中析出，溶液中各组分浓度逐渐增大，直至饱和，最终各组分就可能析出晶体或无定型物；或者依然保持过饱和状态，当溶液浓度达到最大冻结浓缩状态时，玻璃态转化发生，此时的温度即为玻璃转化温度，在冰晶的间隙中就形成了一个玻璃态的基质。此外，表面诱导破坏和低温对疫苗稳定性也有影响。表面诱导破坏主要与大量冰水界面的形成，或瓶壁与疫苗的相互作用有关[36]，而添加非离子表面活性剂可以消除这种破坏作用。低温对蛋白质结构的影响已有文献报道[37，38]。

3.4 玻璃转化温度

玻璃转化温度（Tg）是一个冻干疫苗特性的重要参数，无论是生产过程中第一、第二干燥阶段，还是在储存过程中，疫苗的温度都不能超过其Tg。冻干疫苗在储存过程中，当环境温度超过其Tg时，疫苗的玻璃化状态被破坏，外观出现塌陷、表面萎缩、结块、变硬、变色等问题，同时疫苗的多孔结构被破坏，吸水性变差。因此，选用Tg高的辅料对保持疫苗的玻璃化和提高疫苗稳定性有利。

4  小结

耐热冻干保护剂因其独特的生产工艺条件，为许多疫苗特别是对温度敏感的抗原和水溶液中不稳定的抗原提供了稳定的制备方法，发展十分迅速。但冷冻干燥是一个伴随有热质转换发生的非常复杂的物理化学变化过程，在冻干过程中冷冻浓集引起的高盐浓度、pH 值变化和干燥失水引起的表面作用都会对疫苗抗原结构稳定性产生影响。除此以外，对疫苗稳定性有重要影响的因素还有水分含量、保护剂结晶等。

为了提高耐热动感活疫苗的稳定性，研究人员对冻干生产工艺和保护剂选择进行了大量的研究，其中保护剂的选取对提高其稳定性尤为重要。一个优良的冻干保护剂要对保持疫苗的玻璃化有利，因为玻璃化的疫苗不仅复溶速率高，物理性状好，而且质量稳定性高。

虽然，目前已掌握了一些耐热冻干保护剂的作用机制，但不同的抗原稳定性不同。仍需要进一步深入研究保护剂机理，最终提供满足不同条件的有效稳定的保护剂，为生产出质量合格稳定的活疫苗提供保障。