马君1*，王栋2
（1.北京海淀中海动物保健科技公司，北京，100081；2.中国兽医药品监察所，北京，100081）
［摘要］ 接种狂犬病疫苗是目前防治狂犬病的唯一有效措施。根据狂犬病疫苗发展的不同阶段，从巴斯德首次研制的狂犬病神经组织疫苗到高度纯化的细胞疫苗，将狂犬病疫苗进行了分类，并对各类狂犬病疫苗的作用机理、生产应用以及优缺点分别予以了阐述。
［关键词］狂犬病，疫苗，进展
狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies Virus）引起的一种人畜共患传染病。全世界每年约有6万人死于狂犬病［1］。我国每年狂犬病发病人数在印度之后，居世界第二位，近几年每年约1000～1200万人接受狂犬病暴露后接种［2］。目前本病几乎无有效的治疗办法，只能通过接种疫苗来预防。
从巴斯德首次制成狂犬病弱毒疫苗以来，各国不断完善并研制了更加安全有效的人、兽狂犬病疫苗，主要有以下几种。
1．弱毒疫苗
1885年，法国科学家巴斯德首次用兔脑脊髓制备成狂犬病弱毒疫苗，应用于人体治疗获得了成功［3］。目前弱毒疫苗仅在少数发展中国家用于人体免疫，而更多用于欧美等国野生动物及发展中国家的家养动物。弱毒疫苗所使用的毒株主要为SAD衍生株，如SAG1和ERA等［4］。其中欧洲应用SAG1株接种野生动物［5］。我国目前生产ERA株活疫苗，最近又重新修订了用Flury株生产活疫苗的制造及检验试行规程，对于已取得GMP认证的企业可申请产品的批准文号。
狂犬病弱毒疫苗在体内的增殖过程与病原感染机体的过程相似，能诱导产生细胞免疫和体液免疫，且产生的免疫反应较强，持续时间较长，在我国狂犬病防制工作中曾起到一定的积极作用。但由于我国目前对活疫苗安全监测与监管制度尚不完善，狂犬病毒流行毒株与疫苗株之间分子流行病学的亲缘性研究尚不充分，对于活疫苗的安全性尚存在争论。
周桂兰等对2种国产狂犬病活疫苗（ERA株）的免疫抗体监测结果表明，对6月龄以上、5岁以内的成年健康犬1次接种后6个月和8个月，分别有28.57%和5.71%的犬抗体水平高于0.5IU/mL（WHO确认的抗体保护水平），半年后再进行2次接种，有81.82%的犬抗体水平达到0.5IU/mL［6］。而英国对Nobivac 狂犬病灭活疫苗的监测结果是，6个月至12.5岁的成年犬1次接种失败率为5.7%。在2006年5月召开的我国首届人兽共患病研讨会上，弱毒疫苗的安全性再次成为争论的焦点，张永振等从浙江、熊毅等从广西分离的狂犬病毒株与兽用狂犬病活疫苗毒株ERA核苷酸同源性高达99.1%［7］。
据文献报道，有的疫苗毒株本身对乳鼠致病，对怀孕动物、免疫机能不全的动物和幼小动物使用不安全，而且存在毒力回升、返祖的潜在危险。例如，SAD－B19突变株SAD－L16对成年鼠皮下注射30FFU/鼠，可导致100％死亡；SAD－D29对1－2日龄乳鼠致病，对成年鼠注射106FFU/鼠不致病［8］。另外，在接种弱毒疫苗的动物口腔中有残毒检出［9，10］，存在一定的安全隐患。鉴于此，WHO认为狂犬病疫苗株可能导致狂犬病感染的发生，提出使用狂犬病灭活疫苗代替弱毒疫苗来最终消灭人和动物狂犬病［11］。
2．灭活疫苗
灭活疫苗的抗原蛋白在体内主要以外源性方式进行抗原提呈，被接种动物以产生体液免疫为主。人用狂犬病疫苗多为灭活疫苗，欧美等发达国家对家养动物也使用灭活疫苗进行接种。国外生产狂犬病疫苗的毒株多为PM株和Flury 株，我国使用CTN和aG株。其生产工艺从淡苗、浓缩苗发展到高度纯化的精制苗，不断提高其免疫原性，减少副反应的发生。
2．1第一代疫苗——神经组织灭活苗(NTV)
2．1．1 Semple灭活苗 1911年，Semple将羊脑组织悬液于37℃经0.5－1.0％酚固定、β-丙内酯灭活后，制备了Semple疫苗。1925年，Hempt通过补加乙醚处理，进一步确保了疫苗的无毒性［12］。我国于1949年～1980年间生产由羊脑制备的Semple疫苗。
2．1．2 新生鼠脑疫苗（SMBV） 1955年，Fuenjalida和Palacios将狂犬病毒脑内接种3～5日龄的新生鼠，于接种后4 天收集脑组织，制备了新生鼠脑疫苗（SMBV）。由于新生鼠脑神经组织中仅存在少量鞘磷脂，所以引发的副反应较少。在过去的40多年里，南美洲广泛使用此疫苗。
由于神经组织疫苗注射量大（每针2mL）、接种次数多（14针以上）、抗体产生慢、水平低，含有神经麻痹因子，易引发变态反应，而且疫苗中易残留有感染性的活病毒。世界卫生组织（WHO）狂犬病专家委员会已提出尽快停止使用神经组织疫苗［13］。但在印度等国家至今仍在使用。
2．2第二代疫苗——鸭胚疫苗（Duck Embryo Vaccine, DEV）
1955年，Peck制备了鸭胚疫苗（DEV）。1959年，Powell和Culbertson改进了DEV 的生产工艺，制备的疫苗中含有10%经β-丙内酯灭活的鸭胚组织悬液。DEV引起变态反应的危险性小，但抗体效价低，曾在美国作为狂犬病暴露后接种应用了25年。瑞士应用化学溶剂提纯法生产出了高度纯化的鸭胚疫苗(PDEV)，目前在亚、非和南美洲一些国家使用［14］。
2．3第三代疫苗——细胞培养苗
2．3．1原代细胞培养疫苗
原代地鼠肾细胞疫苗（Purified Hamster Kidney Cell Vaccine, PHKCV）：加拿大最先在原代地鼠肾细胞上培养狂犬病毒SAD株进行疫苗生产，1968年加拿大批准该疫苗用于人体接种。前苏联使用Vnukovo-32株，生产由叙利亚地鼠肾细胞制备的紫外线灭活疫苗，后来采用离心纯化技术改进了生产工艺。我国自1980年开始生产此苗，将北京株兔脑固定毒在PHKC上培养收获，经甲醛灭活，加Al(OH)3佐剂制成疫苗［12］。1993年开始生产浓缩3～5倍的PHKCV，但人体接种副反应明显增多而且严重，2001年后开始推广高度纯化的PHKCV。我国生产的PHKCV曾是世界上累计生产量最大的狂犬病疫苗。
精制鸡胚细胞疫苗（Purified Chicken Embryo Cell Vaccine, PCECV）：1965年，日本将狂犬病毒Flury-HEP株适应到鸡胚成纤维细胞（CEC）制成疫苗。1983年，德国的Barth使用Flury-LEP株在CEC上培养，收获的病毒悬液经β-丙内酯灭活、离心纯化和浓缩制成疫苗。现在，PCECV已在欧、亚、非和拉丁美洲的20多个国家获得了生产许可证。1997年10月，FDA批准该疫苗进入美国市场。此苗生产工艺简单，病毒滴度高，免疫效果与HDCV相当，使用后仅产生轻微的局部反应，因而受到WHO重视［15,16］。目前我国也有该类进口疫苗的应用。
鹌鹑胚细胞疫苗（Japanese Quail Embryo Vaccine, JQEV）：日本将MNIIVP-74株适应于鹌鹑胚细胞，制备成疫苗接种人体，免疫效果比较理想。
犬肾细胞疫苗（MDCKV）: 1978年，Van Wezel等使用狂犬病毒PM株适应犬肾细胞，并使用微载体技术进行大规模生产，在荷兰进行人体暴露前后的接种试验，获得了较好的免疫保护，1980年荷兰批准生产此苗。
牛肾细胞疫苗(MDBKV)：将狂犬病毒PV11株经胎牛肾原代细胞大规模培养，收获病毒经灭活、浓缩纯化后制成疫苗。法国批准此苗用于暴露前后的预防接种。
2．3．2二倍体细胞疫苗
人二倍体细胞疫苗(Human Diploid Cell Vaccine, HDCV)：1964年，美国Wistar研究所使用人二倍体细胞株WI-38培养狂犬病毒PM株，收获病毒液经澄清、β-丙内酯灭活和冻干后制成疫苗。该疫苗于1974年首次获准生产，1978年开始商品化。HDCV的优点是安全性好，具有较高免疫原性，是评价任何一种人用狂犬病疫苗的标准疫苗。但此苗生产工艺复杂，价格昂贵，仅在美国、加拿大、大多数欧洲国家和少数亚洲国家使用。
狂犬病吸附型疫苗（Rabies Vaccine Absorbed, RVA）：将狂犬病毒Kissling株适应胎恒河猴肺成纤维细胞，收获的病毒悬液经β-丙内酯灭活、磷酸铝吸附浓缩后制成疫苗。此苗变态反应发生率较低，与HDCV接种程序相同，目前在美国应用。
2．3．3传代细胞系疫苗
纯化Vero细胞狂犬病疫苗（Purified Vero Rabies Vaccine, PVRV）：1984年，法国Merieun研究所在微载体悬浮培养的Vero细胞上繁殖狂犬病毒PM1503-3M株，收获的病毒液经超滤浓缩、密度梯度离心、β-丙内酯灭活后制成冻干疫苗。由于该苗免疫原性好、安全、稳定，可大规模生产，产量高，价格便宜，WHO推荐使用Vero细胞大量生产狂犬疫苗，并于1987年颁发了Vero细胞生产人用纯化狂犬病灭活疫苗规程。目前PVRV在全世界使用范围较广。我国于1995年开始进行人用纯化Vero细胞狂犬病疫苗的研制，使用毒株为CTH-1、aG和PM株，已有多家生物制品厂获得了生产文号［17，18，19］。
有研究表明，Vero细胞系在142代内无潜在的致瘤性，所以使用低代数Vero细胞制备疫苗，并且应用纯化技术使残余细胞DNA量小于100pg/剂，可以最大限度地减少其致瘤性。
幼仓鼠肾细胞疫苗（BHKV）：BHK细胞是狂犬病毒的高产细胞，可在生物反应器中大规模培养。早在上个世纪70年代，就有利用Flury- LEP株狂犬病毒在BHK细胞上生产兽用灭活狂犬疫苗的报道。目前，法国维克用BHK21细胞生产的犬、猫用狂犬病疫苗在法国获得了生产文号，并在我国进行了注册。
在进行狂犬病疫苗研究的同时，对于疫苗的接种程序也不断进行了改进。灭活疫苗暴露前接种：第0、7和21（或28天）于臂部三角肌各注射1剂疫苗，并每两年加强1剂。暴露后接种：第0、3、7、14、28天分别于上臂肌肉注射1剂狂犬疫苗［20，21，22］。在泰国等发展中国家也在推广使用比较经济的皮内接种法，免疫效果与肌肉接种的相当。
3．基因工程疫苗
狂犬病毒糖蛋白具有病毒的中和抗体决定簇，与病毒的感染和毒力直接相关，不同毒株的糖基化位点有所不同；核蛋白的氨基酸序列高度保守，除了可诱导机体产生非中和性抗体外，主要诱导机体产生细胞免疫［23］，目前狂犬病基因工程疫苗主要围绕糖蛋白和核蛋白展开［24，25，26，27］，主要有重组活载体疫苗、亚单位疫苗和基因疫苗等。
重组活载体疫苗中以痘苗病毒为载体的V-RG研究的最为透彻、使用也最多。V-RG对欧洲及北美等地的野生动物进行口服免疫，已取得良好的免疫效果。我国第一株狂犬病毒糖蛋白重组天坛株痘苗病毒已研制成功。但WHO曾宣布全球消灭天花，不再接种痘苗疫苗，并且有研究表明，痘苗重组病毒接种人类后，可长期抑制再次免疫接种，因此狂犬病重组痘苗载体疫苗的使用范围有一定限制。对以金丝雀痘病毒、鸡痘病毒［28，29］、浣熊痘病毒［30］和人腺病毒5型构建的重组体研究也较多，狂犬病毒糖蛋白和核蛋白也已在大肠杆菌、酵母菌、杆状病毒－昆虫细胞等多种表达系统中表达，狂犬病基因疫苗对小鼠、犬、猫及猿等动物的接种试验也有报道［31］，但均未有商品销售。
动物狂犬病是人狂犬病的根源，消灭动物狂犬病关键要加强对动物的免疫接种，WHO提出应用灭活疫苗来最终消灭狂犬病。欧美等发达国家控制狂犬病最成功的经验在于采用灭活疫苗免疫家养动物、弱毒疫苗和重组活载体疫苗免疫野生动物。近年来我国犬、猫等宠物数量持续上升，狂犬病流行十分严重，国家对动物强制接种的力度不断加大，对狂犬疫苗的需求也日益增加。而国产动物用狂犬病疫苗只有弱毒疫苗，灭活疫苗只能进口，且价格昂贵。由于弱毒疫苗存在一定的不安全因素，重组活载体疫苗与基因疫苗仍处于试验阶段，迫切需要研制一种安全有效的狂犬病灭活疫苗。本实验室目前正致力于狂犬病灭活疫苗的研制和开发，争取为我国狂犬病防制工作做出贡献。
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The Research Progress of Rabies Vaccine
MA Jun1, WANG Dong2
(1. Beijing Zhong Hai Animal Science &Technology Co., Beijing 100081；2. China Institute of Veterinary Drug Control，Beijing 100081)
Abstract: The efficient method to prevent and control Rabies is vaccination. Since Pasteur made the first vaccine for post-exposure treatment, many other Rabies vaccines for human and animal uses have been developed. According to the research progress of Rabies vaccine, these vaccines were classified, and mechanism, production, application, as well as merit and demerit of these vaccines were overviewed.
Key words: Rabies; vaccine; progress
本文被收录在《中国畜牧兽医学会生物制品学分会第十次学术研讨会论文集》．2005年11月．广州，已作修改。
1* 马君（1974年~），女，汉族，黑龙江省鸡西市人，预防兽医学硕士，兽医师，从事动物生物制品研发工作。E-mail: mjhlj@sohu.com。
